Princip rada Pasteurove pipete prvenstveno se zasniva na gravitacionom-pokrenutom protoku i kapilarnom djelovanju, u kombinaciji s ručnom kontrolom diferencijalnog pritiska zraka kako bi se olakšala aspiracija i prijenos tečnosti.
Ručna kontrola usisavanja: Operater primjenjuje usisavanje na široki kraj pipete-bilo oralno ili pomoću pomoćne gumene sijalice-kako bi stvorio negativan tlak unutar cijevi, čime se uvlači tekućina u fini vrh.
Gravitaciono{0}}Doziranje: Kada se usisavanje pusti, tečnost prirodno ističe pod uticajem gravitacije; doziranje se također može pomoći blagim stiskanjem tijela pipete ili naginjanjem posude za prijem.
Reproducibilnost kapljica: Kalibracijom omjera "kapi po mililitru", pipeta omogućava približan kvantitativni prijenos, što je čini pogodnom za postupke koji zahtijevaju ponovljivost, a ne apsolutnu preciznost.
Osiguranje sterilnosti: Prije upotrebe, pamučni čep se može umetnuti u široki kraj i sterilizirati kako bi se spriječila mikrobna kontaminacija tokom rukovanja-što je praksa posebno uobičajena u mikrobiološkim eksperimentima.